在傳統的小分子藥物研發中，決定靶點特異性與DMPK（分布、代謝和藥代動力學）的結構特征往往密不可分，很難相互獨立的進行設計和優化。與之不同，寡核苷酸類藥物的藥效團和藥代動力學性質在理論上可以分別優化，這是因為寡核苷酸類藥物的核苷序列直接決定前者，而其磷酸酯骨架的化學性質很大程度上影響后者。目前，寡核苷酸類藥物有超過155項正在進行的臨床試驗，并已有多個獲批上市的藥物，其中大部分都含有修飾的磷酸酯骨架。遺憾的是，盡管有機合成的進步對現代藥物化學的發展產生了深遠的影響，但是隨著寡核苷酸序列和可能的磷酸酯骨架的范圍擴大，寡核苷酸合成的基本化學卻鮮有重大進步。如圖1所示，一段含有四種不同磷基連接結構以及多種糖骨架的嵌合寡核苷酸序列，如果使用已有方法合成，所面臨的巨大困難也從某種程度上凸顯了現有方法的局限性，理想中可以隨意地以任何順序安裝更廣泛的組合和變化就顯得更加遙不可及。如此說來，寡核苷酸的商業化，更具體地說，廣受期待的硫代磷酸酯反義寡核苷酸（PS-ASO）的商業化面臨著重大挑戰。
2018年，美國斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute，TSRI）的Phil S. Baran教授與制藥巨頭百時美施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）的Ivar M. McDonald、Martin Eastgate、Michael Schmidt等研究者合作發展了一種基于P(V)的磷硫試劑（稱為PSI或ψ）來解決立體純硫代磷酸酯（R-PS和S-PS，主要在DNA環境下）寡核苷酸的合成問題（Science, 2018, 361, 1234–1238，點擊閱讀詳細）。然而，這項初步研究也有尚未解決的問題，比如其他類型磷酸酯骨架連接結構如二硫代磷酸酯和天然磷酸二酯的安裝，如鎖核酸（LNA）的其他糖化學，以及對現代自動化合成的適用性。解決這些問題，要面對不少挑戰，比如：1）P(V)試劑曾被認為反應速率過于緩慢，無法與P(III)歧化相競爭；2）鳥嘌呤和胸腺嘧啶堿基的影響會導致不同的化學選擇性；3）使用現有基于P(III)的試劑來安裝二硫代磷酸酯連接結構并不理想；4）當前修飾磷酸酯骨架的方法步驟復雜，存在氧化與脫保護以及產物分離等問題。鑒于此，開發一種高度選擇性和兼容性的自動化寡核苷酸合成方法就顯得尤為重要，會對寡核苷酸類藥物的研發和商業化產生深遠影響。
在此前工作基礎上，Baran教授等人近日再獲重要進展。通過利用ψ2（3）、rac-ψ（4）和ψO（5）三種新試劑，并與已報道的[(+)-ψ, (+)-2]和[(?)-ψ, (?)-2]體系相結合，他們開發了一種完全不同于P(III)基寡核苷酸合成的通用P(V)平臺，實現了特定寡核苷酸序列的任意受控合成（圖1C）。該方法不僅能夠減少保護基化學的依賴、特殊試劑、氧化試劑等多個方面的問題，而且還去掉了標準固相寡核苷酸合成（SPOS）方案中的一個完整步驟（即磷氧化過程）。相關成果于近日發表在Science上。
相比于ψ2與ψO的合成，rac-ψ的合成相對簡單，以環氧環己烷為原料類比ψ即可獲得。為此，作者對含有二硫代磷酸酯ψ2和天然磷酸二酯的ψO試劑的合成進行了探索（圖2）。盡管1995年化學家報道了二硫代磷烷（dithiaphospholanes）可以安裝在核苷上并與其偶聯，以合成含有二硫代磷酸酯連接結構的二核苷酸，但是安裝硫需要單獨的氧化步驟以及有毒且不穩定（爆炸性）的試劑（圖2A）。鑒于此，作者以去除氧化步驟和危險試劑為目的，選擇P(V)為中心來設計合成二硫代磷酸酯ψ2。在確定最佳離去基團與環大小兩個因素后，作者發現廉價的P2S5可以與五氟苯酚結合，然后用環硫乙烷與P(V)中間體（6）進行反應，能夠大規模（>100 g）地合成含有二硫代磷酸酯結構的ψ2（3）。類似地，作者評估了近30個不同骨架以及3個不同離去基團，其中骨架優化系統地評估了環大小、取代基、電子效應以及立體化學對位阻、偶聯和整體穩定性的影響，并發現ψO是唯一可行的試劑。隨后，作者以簡單、可規模化（>50 g）的步驟合成了ψO試劑（圖2A）。具體而言，廉價的P2S5與4-溴苯硫酚進行反應得到P(V)中間體（7），后者與氫化cis-檸檬烯環氧化物（8）結合生成PS試劑（9），最后經SeO2脫硫便可獲得ψO（5）。
接下來，作者將P(V)平臺與目前最先進的P(III)方法進行了比較（圖2B），結果顯示P(V)平臺比P(III)方法步驟更簡便、產物純度更高（>99%）且不會產生PS雜質。為了進一步測試和對比兩個平臺的優缺點，作者對混合PO-PS主鏈的合成進行了探索。以P(III)方法為例，PS二聚體（13）與PA-dT（18）發生亞磷酰胺偶聯反應得到被保護的三聚體（14），后者經氧化得到目標產物和脫硫副產物的混合物。相比之下，使用氧化還原中性P(V)方法則能夠成功地制備未保護的混合PS-PO三聚體（19），同時沒有任何硫損失。
這種P(V)方法要面臨的另一個大挑戰是能否克服經典P(V)試劑較慢的偶聯速率問題，以適應傳統的自動化寡核苷酸合成方案。作者基于P(V)全套試劑，采用動力學研究評估了P(V)平臺的偶聯性能，結果顯示經典的基于P(V)的磷酸三酯方法非常緩慢（圖2C，橙色條），而本文詳述的P(V)試劑平臺與行業標準P(III)方案的性能相同，所有反應均在兩分鐘內達到完全轉化。
在過去的30多年里，基于亞磷酰胺合成的SPOS方法得到了不斷優化。盡管其中一些方法或許也可繼續使用，但在某些方面現有解決方案與P(V)合成方法并不兼容（圖3A）。目前，通用的載體對于1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）不夠穩定，為此作者使用 Pya 保護基代替標準的酰胺保護基，開發了一種穩定性顯著改善的通用載體（20，圖3B）。同時，當對胸苷使用Pom保護時，也獲得了更好的結果。其次，作者在確定所有P(V)試劑的化學選擇性和相對偶聯速率后，對氧化還原中性P(V)平臺在自動化 SPOS 上的效率進行了系統的研究。第一步，樹脂結合核苷的DMT基團去保護得到游離的5?-醇，后者與P(V)的核苷酸進行反應，隨后發生封蓋和解封步驟完成了固相循環，并為下一次偶聯奠定了基礎。
接下來就是合成的實戰檢驗。任何新試劑系統要用于寡核苷酸合成平臺，必須先證明在使用單一方案制備不同序列的情況下仍能保持高保真度和穩健性。為了檢驗新P(V)平臺的成色，作者設計了一種寡核苷酸分子結構“矩陣”，以將所有可能的核堿基（A、C、G、T）和糖（DNA和LNA）組合引入到3-10-3 DNA/LNA gapmer框架上，這也是目前RNase H激活反義寡核苷酸中最先進的技術（圖3C）。無論P(V)單體是用于評估該方法的通用性還是用于序列特異性優化，作者使用的均是單一方案。首先，作者測試了這種方法的通用性，合成了具有交替（21, 22）和連續立體化學結構（23-26）的均質、手性PS-ASO。值得一提的是，這種使用氧化還原中性P(V)基試劑的方法是第二個工業上可行的生產立體純PS-ASO的平臺。隨著這一重要目標的達成，作者開始將 PO2 連接結構引入這些分子結構中，以高純度獲得了嵌合序列（27-30），合成過程中硫沒有實質性的損失。接下來，作者制備了同時帶有PS和 PS2連接結構（31-34）的寡核苷酸序列以及含有所有四種可能連接結構的寡核苷酸序列（35, 36）。最后，為了證明這種P(V)寡核苷酸合成平臺的優勢，作者基于ψ 的衍生物rac-ψ（圖1），在該平臺上合成了外消旋PS寡核苷酸（37、38）（圖3D）。
總結
寡核苷酸療法能夠直接調控基因表達，被認為是繼小分子藥物和蛋白質類藥物之后的新一類藥物開發熱點方向。迄今為止，已被研究的寡核苷酸修飾數量十分有限，在臨床中的應用甚至更少，說到底，原因還是在于合成水平跟不上。基于P(V)試劑合成寡核苷酸早已有之，但由于化學選擇性低及反應性差等問題而無法擔當大任。Baran教授等人的這項工作可以說使P(V)策略煥發新生，讓人們獲得希望的寡核苷酸嵌合序列成為可能。更有意義的是，這一P(V)平臺兼容商用的寡核苷酸自動化固相合成系統，應用前景光明。盡管該平臺分離收率（12-27%）還不算太高，但經過一定的優化，未來應該也不會是太大問題，即便在現在，這個水平的收率也足以支持藥物化學的實驗室研究。
